Le métabolisme de l'oxygène et la toxicité des espèces oxygénées activées, plaque tournante de l'action de nombreux agresseurs

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Le deuxième cours (6 mars 2014) a porté sur la signalisation redox. Après la mise en évidence du rôle des ROS dans les pertes auditives liées à l’administration d’aminoglycosides (et du cisplatine), ce cours s’est intéressé a un aspect nouveau des effets des espèces oxygénées, la signalisation redox.

Tandis que l’augmentation de O₂ déclenche une réponse adaptative qui implique la signalisation redox médiée principalement par le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂), sa faillite se traduit par la production de ROS, parmi lesquels des radicaux libres (tels que OH, O₂^–, RO₂), et des produits non-radicalaires (tels que H₂O₂, RO₂H) (Gardes-Albert et al., 2003), conduisant au stress oxydant, caractérisé par des dommages cellulaires irréversibles. Longtemps, la signalisation redox a été masquée par l’effet des ROS sur toutes les macromolécules biologiques : ADN, protéines, et lipides. Découverte il y a une quinzaine d’années dans le champ de l’immunité, son caractère ubiquitaire a depuis été reconnu. H₂O₂ n’est pas à proprement parler une espèce réactive, car ce composé ne possède pas d’électrons non appariés. Son aptitude à la signalisation tire parti de cette absence de réactivité qui lui permet de diffuser, donc d’agir à distance. L’anion superoxyde (O₂^–) est considéré comme un messager potentiel de cette signalisation. Des données récentes suggèrent en effet qu’il pourrait, par inactivation d’un ensemble de protéines, conduire à l’activation de voies de signalisation qui, soit favoriserait l’adaptation à H₂O₂,soit déclencherait une première étape vers la mort cellulaire. La signalisation redox, mise en place lors du passage à la vie aérobie, a un rôle essentiel, comme en témoigne le fait que l’absence du glutathion, agent réducteur majeur de cette signalisation, est incompatible avec la vie.

H₂O₂provient soit de la dismutation de O₂^– par les superoxyde dismutases (SOD), soit de l’activité de diverses oxydases. Les SOD sont au nombre de trois chez l’homme : deux sont du type CuZn-SOD, SOD1 (cytoplasmique et mitochondriale) et SOD3 (extracellulaire), et une est du type Mn-SOD, SOD2 (mitochondriale). Une variété d’oxydases produisent H₂O₂ : les oxydases des acides gras à longue chaîne et des acides gras branchés, situées dans le peroxysome, les oxydases de la xanthine et de l’hypoxanthine, dans le cytoplasme et le peroxysome, les monoamines oxydases, dans la mitochondrie… O₂^–, quant à lui, est formé soit dans la mitochondrie par la capture par O₂d’un électron provenant de l’activité des complexes mitochondriaux I et III, soit dans la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique par l’oxydation du NADPH par les NADPH oxydases (NOX et DUOX). La régulation de sa production dans la mitochondrie est mal connue. Il en est de même du rôle de l’O₂disponible, puisque l’hypoxie aussi bien que l’hyperoxie conduisent à une production excessive de ROS.

H₂O₂est réduit en H₂O par trois voies impliquant trois peroxydases différentes (Bindoli et al., 2008) : les peroxyrédoxines (Prx) dépendantes des thiorédoxines (Trx), les glutathion peroxydases (GPx) dépendantes du cycle du glutathion (GSH), et la catalase située dans le peroxysome. Il y a compétition entre la dégradation d’H₂O₂ et son rôle dans la signalisation redox.

La signalisation redox consiste en la conversion réversible des résidus cystéines de protéines (plusieurs centaines) ou peptides, d’une forme réduite en une forme oxydée. On estime à 5 mM la concentration cellulaire des groupements thiols des protéines qui peuvent intervenir dans cette signalisation. Les changements conformationnels induits se traduisent par des modifications d’activité (augmentation ou diminution d’activité enzymatique, par exemple), de propriétés biophysiques (stabilité des protéines, par exemple), de localisation subcellulaire, et d’interaction moléculaire. En présence d’H₂O₂, le groupement thiol des cystéines sous forme d’anion thiol (Cys-S^–) ou de thiol protoné (Cys-SH) peut prendre une forme sulfénique (Cys-SOH) (Finkel, 2011). Cette conversion dépend de l’état des thiols (les anions thiols sont plus réactifs que les thiols protonés), et de la nature de la protéine ou du peptide qui les portent (la vitesse de conversion est très différente d’une protéine ou d’un peptide à l’autre). La forme sulfénique des thiols des cystéines peut conduire à un changement de l’activité catalytique de certaines enzymes ou de l’activité de facteurs de transcription impliqués dans la réponse au stress oxydant. Les cystéines sous forme sulfénique sont, de plus, des intermédiaires de la formation de ponts disulfures (intra- ou intermoléculaires), qui sont bien plus stables et jouent un rôle essentiel dans le repliement des protéines. La méthionine, autre acide aminé soufré, pourrait être à l’origine, elle aussi, d’un système redox. Cependant, sa vitesse d’oxydation est plus faible que celle de la cystéine. Des données récentes suggèrent que la polymérisation de l’actine et l’activité de CAMKII (Ca²⁺/Calmodulin-dependent kinase) seraient régulées par l’oxydation de certaines de leurs méthionines. Le retour à l’état réduit (anion thiolate) des thiols des cystéines sous forme sulfénique ou de ponts disulfures requiert un agent réducteur, le glutathion, ou une activité enzymatique qui échange thiols oxydés et thiols réduits, qu’il s’agisse de celle de disulfure réductases, de thiorédoxines (Trx) ou de glutarédoxines (Grx). Grx et Trx ont des structures tridimensionnelles comparables. Ces petites molécules sont de puissants antioxydants ; elles possèdent dans leur site actif plusieurs motifs de type CXXC (C = cystéine et X = n’importe quel acide aminé), qui se comportent comme des détecteurs de l’état d’oxydation. Enfin, une oxydation plus poussée des formes sulféniques des cystéines conduit à des formes sulfiniques (SO₂H), dont la réversion fait appel à des sulfirédoxines, puis sulfoniques (SO₃H), un état d’oxydation irréversible qui altère les protéines.

La compréhension de cette signalisation redox n’en est qu’à ses débuts. Il reste de nombreuses questions à résoudre. En particulier, comment cette signalisation peut-elle être spécifique alors que l’agent de signalisation, H₂O_2, diffuse, y compris à travers les membranes, et peut interagir avec de multiples cibles ?

Pour répondre à ces interrogations, des sondes « bio-détectrices » redox utilisables en imagerie in vivo ont été développées. Elles permettent de suivre en temps réel, dans des conditions expérimentales d’intérêt, le statut redox des différents compartiments cellulaires : mitochondries, noyau, et cytoplasme. Nous avons vu comment ces outils ont permis de mettre au jour l’existence d’un dialogue entre la mitochondrie et le noyau, impliquant la signalisation redox. In fine, il se traduit par des modifications transcriptionnelles (Al-Mehdi et al., 2012).

La signalisation par H₂O₂opère directement sur une variété de cibles : (i) des enzymes, les Prx et les GPx (qui réduisent H₂O₂enH₂O) et la tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) ; suite à la modification des thiols de leurs cystéines qui prennent une forme sulfénique, ces enzymes deviennent inactives. La cystéine cible de l’oxydation est située dans le site catalytique de PTP1B ; le récepteur sur lequel elle agit reste alors phosphorylé et actif ; cette cystéine peut être réactivée par une Trx. H₂O₂, en agissant aussi directement sur les Trx, a un effet sur les nombreuses cibles de ces dernières, parmi lesquelles p53, NFkB… ; (ii) des protéines impliquées dans le contrôle de la transcription ; on peut citer l’oxydation des cystéines de KEAP1, protéine qui retient le facteur de transcription NRF2 dans le cytoplasme ; sous l’effet de l’oxydation de ses cystéines sensibles au statut redox, KEAP1 libère NRF2, qui gagne alors le noyau ; après dimérisation avec la petite protéine MAF, il se fixe aux séquences promotrices, dites « éléments de réponse aux antioxydants » (AREs : antioxidant response elements), de gènes qui codent pour des antioxydants ; (iii) des protéases à cystéine (ATG-4, impliquée dans l’autophagie, par exemple) ; (iv) enfin, H₂O₂ oxyde le glutathion, qui a des effets sur les Grx (qui ont de nombreuses cibles), sur les glutathion S-transférases (qui catalysent la conjugaison du glutathion à des substrats endogènes ou exogènes) et les GPx. La compartimentation cellulaire joue un rôle essentiel dans la mise en œuvre et la régulation de ces diverses voies de signalisation. Enfin, les Prx réductases et les Trx réductases, nécessaires au maintien de ces deux peroxydases sous forme réduite, ont pour cofacteur NADPH, qui leur est fourni par la voie des pentoses phosphates et la respiration mitochondriale. Soulignons que plusieurs des enzymes sus-mentionnées portent une sélénocystéine, analogue sélénié de la cystéine dans lequel le groupement thiol est remplacé par un groupement sélénol. La sélénocystéine est le 21^eacide aminé. D’utilisation rare, il est codé par le codon stop UGA. Il est également oxydé par H₂O₂.

Les éléments ci-dessus sont à rapprocher de deux formes de surdité. L’une est une surdité isolée transmise sur le mode autosomique récessif, DFNB25, dont le gène responsable code pour GRXCR1, qui comporte un domaine de type Grx. L’autre est le syndrome de Wolfram, qui comporte une surdité associée à un diabète ; l’atteinte de ce gène est aussi responsable d’une surdité isolée dominante DFNA6/14/38. Le gène responsable code pour une protéine mitochondriale, Miner1, impliquée dans le statut redox des groupements thiols, la réponse cellulaire aux protéines non correctement repliées (unfolded protein response), et l’homéostasie calcique.