Alain Fischer

Nous avons consacré avec Geneviève de Saint-Basile beaucoup d'effort à la caractérisation génétique et moléculaire d'une forme de DICS dont le gène est situé sur le chromosome X et est responsable d'un défaut complet de développement des lymphocytes T et des lymphocytes Natural Killer (NK). Nous avons pu localiser le locus du gène sur le chromosome X en 1984 et surtout observer une amélioration partielle spontanée de cette pathologie grave liée à la survenue d'un « révertant ». Ce phénomène est la conséquence d'un événement de mutation somatique survenu dans une cellule précurseur de lymphocytes T qui, par chance a conduit à la correction de la mutation héritée et ainsi permis, par sélection, la différenciation de lymphocytes T. Cette observation a permis d'estimer le nombre de lymphocytes T qui peuvent être générés à partir d'un seul précurseur. Elle a également constitué l'élément clé du raisonnement qui a conduit à élaborer une thérapie génique de cette maladie (cf. infra) : une seule cellule en se divisant un grand nombre de fois peut générer un très grand nombre de lymphocytes T. Nous avons considéré qu'une forme de thérapie génique « naturelle » avait ainsi par hasard en partie corrigée le DICS de cet enfant. Cette observation illustre comment l'analyse détaillée d'une situation exceptionnelle peut contribuer à comprendre la physiologie (dynamique de développement des lymphocytes T) et à élaborer une nouvelle thérapeutique.

La diversification de la réponse anticorps et ses anomalies génétiques

Les lymphocytes B produisent les anticorps (immunoglobulines) qui reconnaissent des antigènes par leur région dite variable et activent des fonctions cellulaires par leurs régions constantes. Les régions variables sont générées par le processus de recombinaison génétique décrit plus haut. Les régions constantes sont de plusieurs types (M, G, A, E) dotées de fonctions différentes. Un second processus de recombinaison génétique permet, au cours d'une  réponse immunitaire de modifier une immunoglobuline de telle sorte 1) que la région constante change de M à G, A, ou E, et 2) que la région variable acquière (après sélection) une affinité plus élevée pour l'antigène. Il s'agit respectivement de phénomènes de commutation isotypique des immunoglobulines (CII) et de mutations somatiques. Ces événements  propres aux lymphocytes B surviennent dans les organes lymphoïdes secondaires (ganglions lymphatiques, rate) et accroissent la capacité immune des lymphocytes B contre des agents infectieux.

Une étude systématique et approfondie de patients atteints d'un DIH caractérisé par un défaut de CII, notamment menée par Anne Durandy a conduit à identifier ou préciser le rôle des molécules essentielles à cette diversification secondaire des régions immunitaires : il s'agit successivement de la molécule dénommée CD40L, présente à la surface des lymphocytes T nécessaires à la production des immunoglobulines (coopération « T-B »), de la molécule Activation Induced Deaminase (AID) qui induit les modifications de l'ADN, responsable de l'initiation du processus  de recombinaison (CII) et de mutations somatiques de régions variables, de l'Uracil N Glycosylase qui « nettoie » la lésion de l'ADN générée par AID (et d'enzymes de réparation des mésappariements de l'ADN. La molécule AID, d'abord identifiée par T Honjo à Kyoto et dont l'importance s'est révélée par l'étude des pathologies héréditaires humaines est volontiers appelée « le mutateur » des gènes d'immunoglobulines.

La fonction cytotoxique des lymphocytes T et ses anomalies génétiques

Une des fonctions effectrices des lymphocytes T (et des lymphocytes NK) consiste en la destruction d'autres cellules infectées  par des micro-organismes (virus notamment) mais aussi de cellules tumorales. Il s'agit ses lymphocytes « tueurs » c'est bien un processus essentiel de l'immunité anti-infectieuse. On sait qu'il est lié à l'excrétion du contenu de granules cytoplasmiques dits sécrétoires, au contact de la cellule cible. Ces protéines (perforine et protéases) provoquent la mort de la cellule cible selon le procédé dit « d'apoptose ». Nous avons pu identifier avec Geneviève de Saint-Basile une série de maladies héréditaires toutes caractérisées par un défaut fonctionnel de capacité cytotoxique des lymphocytes T (et NK). Ces travaux présentent plusieurs sources d'intérêt. Ils attirent l'attention sur le fait qu'un défaut de cytotoxicité conduit en fait à une réponse immune exacerbée, comme si les lymphocytes tueurs étaient physiologiquement nécessaires à la terminaison d'une réponse immunitaire. Ils ont conduit à identifier une série de molécules dont la fonction est de permettre l'exocytose des granules cytotoxiques selon un programme structuré : migration intracellulaire, arrimage à la membrane, activation et fusion membranaire. Enfin de façon remarquable, ce processus présente des analogies moléculaires étonnantes avec celui de l'exocytose des granules qui contiennent les neuromédiateurs au niveau des synapses entre cellules nerveuses, et ce malgré des différences d'échelle de temps et de taille. Ainsi, une question biologique analogue, l'excrétion régulée de protéines au contact entre cellules a reçu une solution similaire dans deux types cellulaires distincts.

Ces travaux ont également permis de comprendre que ces maladies génétiques provoquent un syndrome dénommé « syndrome d'activation lymphohistiocytaire » dans lequel la sécrétion persistante d'interferon γ est déterminante. Ces résultats montrent comment les cellules cytotoxiques contribuent à terminer une réponse immunitaire antivirale et ouvrent une piste thérapeutique intéressante par neutralisation des effets de l'interferon γ.

Anomalies génétiques du système immunitaire et auto-immunité

Les maladies autoimmunes sont fréquentes, leur prévalence augmente avec l'âge. Elles témoignent douloureusement du fait que les cellules du système immunitaire adaptatif (lymphocytes T et B) sont capables de reconnaître des composants du soi. Ces lymphocytes auto-réactifs ne sont pas normalement pathogènes, autrement dit, ils ne sont pas, hors maladies auto-immunes, impliqués dans des réponses immunitaires. Comment sont-ils placés efficacement sous contrôle ? La réponse à cette question d'intérêt tant théorique (« la tolérance » au soi) que médicale vient à nouveau en partie de l'étude de rares maladies héréditaires responsables d'une susceptibilité à l'autoimmunité. Notre contribution principale avec Frédéric Rieux-Laucat concerne l'identification d'anomalies héréditaires du gène qui code pour une protéine appelée FAS chez des patients atteints d'un syndrome lymphoprolifératif avec auto-immunité. FAS est un récepteur membranaire présent notamment à la surface des lymphocytes T et B. Sa liaison par un ligand : le ligand de FAS présent à la surface des lymphocytes T activés provoque la mort des lymphocytes activés de façon chronique (ce qui est exactement la situation rencontrée pour des lymphocytes spécifiques d'antigènes du soi). Ce système de communication moléculaire qui peut agir de façon intracellulaire (en « cis ») ou intercellulaire (en « trans ») contrôle ainsi l'échappement éventuel de lymphocytes T et B auto-réactifs .

Il a également été montré que des mutations somatiques (« acquises ») du même gène pouvaient favoriser l'émergence de lymphocytes auto-réactifs et ainsi de maladies auto-immunes, puisque de tels lymphocytes acquièrent un avantage sélectif de survie. Cette observation constitue le fondement d'une hypothèse susceptible de rendre compte des maladies auto-immunes courantes : l'accumulation de mutations somatiques  de gènes contrôlant la mort ou la division cellulaire au sein des lymphocytes T et/ou B auto-réactifs, favoriserait leur échappement et donc l'induction d'une auto-immunité, selon un modèle proche de l'oncogenèse. Cette hypothèse est testable (et en cours de test), elle est susceptible de conduire à l'identification de nouvelles molécules importantes dans le contrôle de l'auto-immunité.

Aujourd'hui, l'analyse des défauts héréditaires du système immunitaire, en particulier de sa composante adaptative (lymphocytes T et B) à travers l'identification de défauts génétiquement déterminés, se poursuit. Les capacités actuelles de séquençage du génome, notamment des exomes, c'est-à-dire des parties codantes des gènes ou du génome entier facilitent grandement cette approche. Ainsi, nombre de mutations sont en cours d'étude en relation avec des défauts de développement des lymphocytes T ou B de la survenue de pathologies auto-immunes ou inflammatoires. Certaines de ces maladies correspondent à une forme génétique rare (cause monogénique), de pathologies plus fréquentes, par exemple la maladie de Crohn (maladie inflammatoire de l'intestin). Il est escompté de ces travaux de pouvoir ainsi identifier des voies moléculaires dont des anomalies plus complexes pourraient expliquer ces pathologies et ainsi ouvrir d'éventuelles pistes thérapeutiques.

Nous postulons que la poursuite de l'étude de modèles de maladies génétiques rares responsables de maladies auto-immunes permettra de mieux comprendre le fonctionnement des différents systèmes de contrôle physiologique des lymphocytes réactifs contre les composants du soi. En parallèle, la recherche systématique d'altérations somatiques du génome dans les lymphocytes réactifs contre les composants du soi (cf supra) permettra de tester l'hypothèse du rôle de l'accumulation de telles mutations dans la genèse de l'auto-immunité et d'identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Anomalies génétiques du système immunitaire et thérapeutique

Fondé sur les progrès des connaissances de la physiopathologie des DIH, nous avons cherché à développer des thérapeutiques de ces pathologies dont certaines ont pu ensuite s'appliquer au traitement d'autres maladies. Ces travaux concernent trois domaines : l'utilisation d'anticorps monoclonaux, l'allogreffe de cellules souches hématopoïétiques et la thérapie génique : sur l'observation que chez les rares patients dont les leucocytes sont dépourvus  de protéines d'adhésion leucocytaires « b2 intégrine », (ce qui résulte dans une prédisposition très grave aux infections du fait d'un défaut d'adhésion et de migration des leucocytes), on observe une capacité moindre de rejet de greffe de moelle osseuse, nous avons proposé l'injection d'un anticorps monoclonal anti b2 intégrine comme méthode de prévention du rejet de greffe de moelle osseuse. Cette approche s'est avérée partiellement fructueuse.

Le virus d'Epstein Barr (EBV) provoque chez les individus immunodéprimés (génétiquement ou du fait d'un traitement immunosuppresseur après allogreffe d'organes par exemple), une prolifération non contrôlée des lymphocytes B, parce que ce virus infecte sélectivement ces cellules et induit leur division cellulaire. En l'absence de réponse immunitaire efficace, cette prolifération cellulaire est mortelle. Nous avons montré que l'injection à de tels patients, d'anticorps monoclonaux spécifiques des lymphocytes B, provoque l'arrêt de cette prolifération cellulaire et dans un grand nombre de cas leur guérison. Ces résultats ont, d'une certaine façon, préfiguré le succès actuel d'anticorps monoclonaux dans le traitement de lymphomes primitifs des lymphocytes B.

Nous avons également, selon le même principe, participé aux premières applications de l'emploi thérapeutique d'anticorps monoclonaux anti lymphocytes B pour traiter une maladie auto-immune (anémie hémolytique auto-immune) en détruisant ainsi les lymphocytes B, dont ceux qui produisent les auto-anticorps pathologiques.

Allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

La connaissance croissante de la physiopathologie de nombre de pathologies héréditaires sévères du système immunitaire a conduit à traiter certaines de ces maladies par allogreffe de CSH afin de remplacer les cellules déficientes par des cellules fonctionnelles.

Fondés sur ce principe simple, des résultats tangibles ont été obtenus pour un certain nombre de DIH, de maladies inflammatoires et auto-immunes (déficits en mevalonate kinase, en Fox P3) et de maladies métaboliques (adrenoleukodystrophie).

Thérapie génique des déficits immunitaires héréditaires

Malgré ces succès, l'allogreffe de CSH comporte des limites d'application inhérentes aux risques de complications fatales qui peuvent être trop importantes lorsque donneur et receveur ne partagent pas une compatibilité suffisante des groupes tissulaires HLA. Une alternative consiste en la thérapie génique. Le principe de celle-ci repose sur l'introduction d'une copie normale du gène muté au sein des cellules souches du système hématopoïétique de telle sorte que les cellules filles portent ce gène « thérapeutique » et soient capables d'exprimer la protéine déficiente chez le patient. Les cellules souches sont modifiées « ex-vivo » à l'aide d'un vecteur viral (« rétrovirus ») dont les caractéristiques permettent l'intégration de son génome au sein du génome cellulaire. Ainsi le gène thérapeutique est répliqué lors de chaque division cellulaire et grâce à un système de régulation de son expression (transcription), la protéine correspondante produite.

La première application que nous avons développée avec Marina Cavazzana-Calvo et Salima Hacein-Bey-Abina en fut le traitement du DICS lié à l'X, fondée sur l'observation de l'avantage sélectif conféré aux précurseurs révertants des lymphocytes T. Cette approche s'est avérée fructueuse puisque, pour la première fois, il a été possible de corriger, et ce de façon stable au cours du temps, les manifestations de la maladie. Dix malades à Paris, puis 10 à Londres ont été traités, 17 d'entre eux vivent aujourd'hui dans de bonnes conditions avec un système immunitaire fonctionnel, avec un recul médian qui dépasse 10 ans.

Néanmoins, ce succès fut tempéré par la survenue de cas de leucémie (5 cas/20) consécutifs à la dérégulation aberrante d'oncogènes située à proximité du site d'intégration du rétrovirus. Bien que ces leucémies furent guéries dans 4 cas sur 5, leur survenu a conduit à un arrêt de ces essais, une pause mise à profit pour comprendre le mécanisme de cet effet oncogénique. Celui-ci est aujourd'hui identifié, il est lié à la capacité d'un élément régulateur du vecteur viral de transactiver de façon permanente un gène à côté duquel le virus s'est intégré. Si ce gène est un oncogène, son expression aberrante rend compte du risque de leucémie. Ces travaux ont conduit dans un effort de large collaboration internationale à la mise au point de vecteurs modifiés dans lesquels l'élément transactivateur a été ôté. De tels vecteurs ont été montrés efficaces expérimentalement et sont actuellement testés dans de nouveaux essais cliniques  de traitement de plusieurs maladies : adrénoleucodystrophie (DICS, syndrome de Wiskott-Aldrich). Les toutes prochaines années permettront d'établir si, de fait, leur utilisation permet de conserver l'efficacité  démontrée tout en réduisant le risque d'effets secondaires. Les résultats sont à ce jour encourageants mais la prudence s'impose.

Un volet inattendu de ces recherches concerne l'analyse de la dynamique des populations de lymphocytes T chez l'homme. Chez les patients traités, l'ensemble des lymphocytes T sont porteurs d'une « signature moléculaire » correspondant à l'intégration en un lieu précis du génome cellulaire du vecteur viral. Cette signature peut être identifiée et le nombre de cellules portant la même signature, donc descendantes d'une même cellule progénitrice, quantifié. Il est donc possible de suivre le nombre de progéniteurs impliqués dans la différenciation des lymphocytes, les variations quantitatives de cette diversité et de l'abondance de chaque clone. En couplant ces informations à l'étude de la diversité clonale des lymphocytes T (c'est-à-dire du récepteur pour l'antigène) nouvellement formés et des lymphocytes T « mémoires » (antérieurement engagés dans une réponse immunitaire), il devient possible de générer une image dynamique de l'évolution des populations lymphocytaires T in vivo, en particulier en ce qui concerne leur longévité, leur renouvellement et leur expansion au cours d'une réponse immunitaire.