Élu par l’Assemblée des professeurs réunie en novembre 1855, Claude Bernard donne son premier cours au Collège de France le vendredi 29 février 1856 et poursuit son enseignement tous les mercredis et vendredis de l’année académique 1856 sur le thème des effets des substances toxiques et médicamenteuses. En 1858, il consacre son cours aux Propriétés physiologiques et altérations pathologiques des différents liquides de l’organisme, puis, en 1859, aux découvertes récentes faites en physiologie et à leur application en médecine tandis qu’à compter de 1863, il traite de pathologie expérimentale puis de médecine expérimentale.

L’intitulé de ses cours résume parfaitement ses travaux, lui qui expérimenta les effets du curare à partir de pointes de flèches empoisonnées qu’il s’était procurées d’Amérique du Sud, qui disait : « la physiologie, c’est moi » et qui est par ailleurs le fondateur de la méthode expérimentale, en opposition aux dogmatismes et aux fausses sciences.

Farouchement opposé aux expériences menées sur les humains, et en particulier aux tests médicamenteux sur les malades comme aux opérations chirurgicales aux résultats aléatoires, mais convaincu de la nécessité de tester sur le vivant, Claude Bernard avait régulièrement recours à la vivisection animale, à une époque où modélisation et reproduction de cellules souches n’existaient pas.

Dès 1850, il établit les bases physiologiques de l’anesthésie, en lui appliquant les principes de sa méthode expérimentale, et donne au Collège de France ses Leçons sur les anesthésiques et l’asphyxie de 1871 à 1875.

Claude Bernard, précurseur dans l’application des mesures des sciences exactes au vivant, est également à l’origine de découvertes fondamentales sur la glycémie. Il a étudié le rôle du sucre dans l’organisme animal et humain, découvert le contrôle de la glycémie par le système nerveux central et prouvé la présence de sucre dans le liquide céphalo-rachidien. Grâce à l’expérience dite du foie lavé, il a démontré le rôle de cet organe dans le stockage et la diffusion du sucre dans le sang pour y maintenir un taux glycémique constant.

Bien loin de l’analyse de l’homme-machine à laquelle se bornait une partie de ses contemporains, Claude Bernard a conceptualisé les relations entre les organes du corps et créé la notion de milieu intérieur, dont la stabilité dépend des régulations effectuées par les sécrétions internes. Selon son analyse, « la fixité du milieu intérieur est la condition d’une vie libre et indépendante : le mécanisme qui la permet est celui qui assure dans le milieu intérieur le maintien de toutes les conditions nécessaires à la vie des éléments ».

Excellent pédagogue, il conçoit ses cours comme une initiation aux découvertes scientifiques du moment et en publie régulièrement les résultats dans des revues ou des ouvrages didactiques dont s’empare un large public. La lecture de son Introduction à l'étude de la médecine expérimentale inspire à Émile Zola le manifeste de sa doctrine naturaliste, Le Roman expérimental rédigé en 1880. Et plusieurs ouvrages de Bernard sont traduits en anglais de son vivant.

Claude Bernard occupa la chaire de médecine jusqu’à son décès en 1878, secondé par Auguste Tripier, Paul Bert puis, à compter de 1873 par Arsène d’Arsonval. Ses travaux ont eu un grand retentissement sur des générations de médecins et de biologistes et le concept de milieu intérieur est toujours enseigné aujourd’hui.